Các kết quả của thập kỷ đầu tiên của nghiên cứu CRISPR đã được tóm tắt • Elena Naimark • Tin tức khoa học về "Yếu tố" • Sinh học phân tử, Vi sinh vật, Di truyền học

Kết quả của thập kỷ đầu tiên của nghiên cứu CRISPR

Hình 1. Vi khuẩn Streptococcus thermophilus, trên cơ sở đó sự tồn tại của khả năng miễn dịch thu được của sinh vật nhân chuẩn đã được chứng minh lần đầu tiên và cơ chế của nó đã được tháo rời. Ảnh từ mysticalbiotech.com

10 năm trước, một bài báo đã được công bố bởi nhóm nghiên cứu Danisco của công ty thực phẩm Danisco, trong đó sự hiện diện của khả năng miễn dịch mắc phải trong sinh vật nhân chuẩn đã được chứng minh và công việc của nó dựa trên bảng điểm CRISPR đã được chứng minh. Trong thập kỷ này, khả năng miễn dịch mắc phải của vi khuẩn và cá hồi từ thể loại các hiện tượng kỳ lạ trong thế giới vi khuẩn đã đi vào thể loại tài sản cố hữu của chúng. Các nghiên cứu đã chỉ ra cách nó có thể được hình thành trong quá trình tiến hóa, sự đa dạng của các công cụ phân tử trong miễn dịch CRISPR là gì và quan trọng nhất là nó có thể được sử dụng như thế nào. Tiềm năng sử dụng vi sinh và điều trị của các công cụ phân tử CRISPR thực sự rất lớn, mặc dù công việc gần đây cho thấy rằng chúng cần được cải thiện cho các mục đích lâm sàng.

10 năm trước Rodolphe Barrangou và Philippe Horvath và các đồng nghiệp đã phát hiện ra rằng CRISPR trong prokaryotes có liên quan đến việc mua lại miễn dịch (xem R. Barrangou và cộng sự, 2007. CRISPR cung cấp khả năng chống lại virus trong Prokaryotes). 10 năm là một thời gian rất ngắn cho khoa học, nhưng là một thời gian khá lớn cho một nguyên tắc mang tính cách mạng bão tố.Nhân dịp ngày tròn, Barranga và Horvath, người đã phát động cuộc cách mạng này, được đăng trên tạp chí Vi sinh vật tự nhiên xem xét lịch sử nghiên cứu của CRISPR.

Nhớ lại rằng hệ thống CRISPR là một loạt các lặp lại palindromic, giữa đó là các phân đoạn ngắn của DNA của virus – cái gọi là miếng đệm. Hệ thống này cũng phải bao gồm cas-gens (cas viết tắt của CRISPR-related – "liên kết với CRISPR"). Toàn bộ hệ thống được thiết kế để nhận biết trình tự nucleotide ngoài và để khắc phục nó. Sau đó, kéo nuclease (endonucleases xâm nhập vào Cas, hoặc các phương tiện khác, ví dụ, RNases) đi vào để cắt DNA virus. Do đó, kẻ địch bị vô hại. Nhưng điều này là không đủ: đối với một loại vi khuẩn đã sống sót sau một cuộc tấn công của virus, các phân đoạn palindromic mới với các miếng đệm virus được thêm vào đầu băng (xem băng Gene). Bây giờ một đoạn DNA của kẻ thù bị đánh bại được đưa vào hệ gen của vi khuẩn và sẽ được chuyển giao cho các hậu duệ của vi khuẩn. Đây chính xác là cách miễn dịch thu được được tổ chức trong vi khuẩn và vi khuẩn. Nó được cập nhật liên tục khi một tế bào vi khuẩn gặp phải sự nhiễm virus.

Vào cuối những năm 1980, các báo cáo đầu tiên xuất hiện trên sự hiện diện của vi khuẩn trong bộ gen (Escherichia coli, trực khuẩn lao,cũng như một số cyanobacteria) và lưu trữ của một loạt các lặp lại palindromic với chèn ngắn giữa chúng. Những loại lặp lại là gì và tại sao chúng cần được hoàn toàn không rõ ràng. Chúng được coi là một trở ngại trong việc lắp ráp các đoạn genome. Vào những năm 1990, khi bộ gen của vi khuẩn bắt đầu được sắp xếp theo trình tự (“đọc”), thì lặp lại không phải là một phần tử kỳ lạ của DNA của vi khuẩn và vi khuẩn, mà là một thành phần rất phổ biến trong bộ gen của chúng.

Năm 2002, những lặp lại này được gọi là CRISPR, mà không giống như các đề xuất trước đó (DVR – lặp lặp trực tiếp, TREP – lặp lại song song, LTRR – chuỗi lặp đi lặp lại lặp đi lặp lại, SRSR – lặp lại khoảng cách đều nhau, LCTR – các cụm lặp lại song song lớn , SPIDR – spacer xen kẽ lặp lại trực tiếp), bị mắc kẹt trong khoa học. Nhưng chức năng của những lần lặp lại này vẫn còn mơ hồ, cho đến năm 2005 các tác phẩm (đồng thời ba bài báo từ các nhóm khoa học khác nhau) xuất hiện, trong đó nó nói rằng các miếng đệm giống với các đoạn của chuỗi virus hoặc plasmid. Và không chỉ bất kỳ, nhưng những người phải đối mặt với các quần thể vi khuẩn được nghiên cứu. Do đó, như đã đề xuất trong các bài viết này, hiệu quả của các hệ thống CRISPR có thể hơi giống với sự can thiệp RNA (ức chế sự biểu hiện gen ở các giai đoạn sao chép, dịch hoặc suy giảm mRNA), mặc dù không có sự tương đồng về công cụ can thiệp RNA giữa các cas– không có vật phẩm nào cả.

Tiếp theo là công trình của nhóm khoa học của công ty thực phẩm công nghiệp Danisco, đặc biệt, đã tham gia vào vi khuẩn để sản xuất các sản phẩm axit lactic. Họ đã sử dụng chuỗi CRISPR để phân biệt giữa các chủng vi khuẩn Streptococcus thermophilus (Hình 1), được sử dụng để sản xuất sữa chua. (Rõ ràng là CRISPR nên rất cụ thể đối với các chủng.) Khi dữ liệu CRISPR đủ, chúng phải chịu phân tích cụm. Và đột nhiên nó bật ra rằng các cụm kết quả của lặp lại palindromic có tương quan với sức đề kháng với nhiễm virus khác nhau! Và, quan trọng hơn, các miếng đệm bổ sung với các phân đoạn palindromic được tìm thấy trong vi khuẩn đã trải qua một cuộc tấn công của virus. Vào đầu những năm 2000, các chủng kháng với các loại thực khuẩn đã được sử dụng. Sau khi so sánh các chủng đã được sử dụng trong công nghiệp trong những năm 1980 và 90, với hậu duệ kháng của chúng từ những năm 2000, nó trở nên rõ ràng những gì chính xác cung cấp khả năng chống nhiễm trùng. Các câu đố đã phát triển: các miếng đệm CRISPR xác định khả năng miễn dịch của các chủng vi khuẩn sau khi nhiễm trùng.

Nhóm nghiên cứu của Danisco đã thử nghiệm giả thiết này trong một loạt các thí nghiệm: các chủng đã được xử lý với các phage đã biết và sau đó khớptrình tự nucleotide của bộ gen của chúng. Ngoài ra, họ đã cố gắng bật và tắt các gen khác nhau, bao gồm cas. Và hóa ra, thực tế, những palindromes mới với các miếng đệm virus đang được thêm vào các cuộn băng CRISPR và casgen liên quan đến sự hình thành các trang web CRISPR mới. Họ là (đặc biệt là cas9) là cần thiết cho sự công nhận và trung hòa của các tác nhân virus. Những người tham gia chính của khả năng miễn dịch mắc phải đã lên sân khấu – palindromes, miếng đệm virus và một loạt các gen cas; vạch ra bức chân dung của hệ thống CRISPR-Cas, cung cấp khả năng miễn dịch có được trong vi khuẩn (xem R. Barrangou và cộng sự, 2007. CRISPR đã phê chuẩn).

Lưu ý rằng mặc dù giả thuyết về sự ức chế DNA của virus bằng loại can thiệp RNA đã được đưa ra vào năm 2006 (xem KS Makarova và cộng sự, 2006). , các chất tương tự chức năng với RNAi nhân chuẩn, và các cơ chế tác dụng giả định), khối lượng công việc nghiên cứu hiện tượng này chỉ bắt đầu sau năm 2007 (Hình 2). Điều quan trọng không chỉ là đưa ra một giả thuyết hiệu quả, mà là để chứng minh thực tế của hiện tượng này và xác định "bánh xe và bánh răng" của nó. Sau đó, có khả năng nghiên cứu có ý nghĩa nhắm mục tiêu. Và họ không theo kịp. Hơn nữa, ý thức của khả năng miễn dịch thu được làm rung chuyển thế giới khoa học: sự kế thừa Lamarckian trên thế giớiprokaryotes! cuộc chạy đua vũ trang tiến hóa trong vi khuẩn và thực thể! vi khuẩn có một cơ chế đặc biệt để bảo vệ chống lại DNA ngoại lai do loại nhiễu ở sinh vật nhân chuẩn! Tuyệt!

Hình 2 Lịch sử nghiên cứu CRISPR được chia thành bốn giai đoạn: "Cổ vật" (1990-2000), "Thời Trung cổ" (2000-2007), "Lịch sử mới" (2007-2013) và hiện tại. Thứ tự thời gian của các tác phẩm quan trọng nhất trong lĩnh vực này được thể hiện (số – tham chiếu đến các tác phẩm này, như chúng được đưa ra trong bài viết gốc của R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Một thập kỷ khám phá: các chức năng và ứng dụng CRISPR

Ngay sau đó, một cơ chế tương tự đã được phát hiện. E. coli. Và cho Streptococcus thermophilus một điều kiện bổ sung được mở để nhận biết một chuỗi virus được nhắm mục tiêu: nó là cần thiết trước khi nó được thiết lập bởi một nhóm nucleotide đặc biệt. Ông đã nhận được tên của PAM (protospacer liền kề motif, đó là, một tập hợp các nucleotide, nằm ở phía trước của nhà thám hiểm proto). Và chức năng của Cas9 cũng được tiết lộ: nó là một endonuclease cắt DNA, rút ​​lui chính xác 3 nucleotide sau protopacer. Và sau đó đã có các báo cáo về một yêu cầu khác cho hệ thống nhận dạng CRISPR của chuỗi virus mục tiêu, cái gọi là tracrRNA (tracrRNA, RNA CRISPR trans-activated). ).TracrRNA là một chuỗi 25 nucleotide, bổ sung cho phân đoạn palindromic và nằm trên sợi DNA đối diện từ CRISPR. Đó là lý do tại sao cô ấy có tiền tố "trans" trong tên.

Khi RNA được đọc từ trình tự CRISPR, thu được tiền mRNA dài chưa trưởng thành của 511 nucleotide. Trước tiên, nó phải được cắt thành các mảnh "bên phải" của spacer palindrome – cái gọi là crRNA (CRISPR RNA). Đây là nơi tracrRNA bật, tham gia palindrome và tạo ra các sợi kép ngắn. Trong hình thức này, những người tham gia hệ thống CRISPR có thể học nó (Сas9, Сsn1, RNazIII). Sự xuất hiện ở giai đoạn trung gian của sự trưởng thành của một sợi kép RNA tăng cường sự giống nhau với sự can thiệp RNA: cũng tạo thành một phức hợp của hai chuỗi RNA ghép đôi bổ sung, mà Dicer có thể nhận biết và cắt một sợi dài thành các đoạn ngắn của 25 nucleotide.

Trong những năm tiếp theo, các nhà khoa học đã chỉ ra sự đa dạng của hệ thống CRISPR trong sinh vật nhân chuẩn. Và như thường là trường hợp, sau khi tích lũy dữ liệu về sự đa dạng của các thành phần cấu thành, phân loại xuất hiện. Các hệ thống CRISPR hiện được chia thành nhiều loại, loại và loại phụ, tập trung vào sự khác biệt trong các yếu tố chức năng của Сas và hệ thống nhận dạng DNA hoặc RNA mục tiêu.Mặc dù nguyên tắc của khả năng miễn dịch thu được là giống nhau đối với tất cả các sinh vật nhân chuẩn – hệ thống này được mã hóa trong DNA, nhằm nhận diện các phần DNA hoặc ARN ngoại lai bằng cách sử dụng RNA và phá hủy chúng bằng các endonuclease – có nhiều biến thể.

Có hai loại CRISPR (Hình 3): trong lần đầu tiên, tác nhân chính (tác nhân hoạt động) là phức hợp protein Cascade (phức hợp CRISPR liên quan đến phòng chống vi rút) và endonuclease Cas3, trong thứ hai – Cascade vắng mặt, và endonuclease Cas9 hoạt động. Trong cả hai lớp, có nhất thiết là các protein Сas1 và Сas2, do đó chúng không tham gia vào việc phân loại. Những protein này, khi nó bật ra, đang hoàn thành các mảnh vỡ mới của spacer palindrome đến đầu băng cassette CRISPR.

Hình 3 Đề án của CRISPR-hệ thống và phân loại của họ dựa trên sự khác biệt trong Cas và các phân tử nhắm mục tiêu (DNA hoặc RNA). Hình ảnh từ R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Một thập kỷ khám phá: các chức năng và ứng dụng của CRISPR

Sự khác biệt giữa endonuclease là cơ sở để phân biệt các loại trong các lớp. Loại 1 là endonuclease Cas3, làm giảm một trong hai sợi DNA của virus. Loại 2 là Cas9, giúp cắt cả hai sợi DNA đôi. Loại 3 – Cas10 (ở một số nơi, cắt RNA mục tiêu). Loại 4 – Csf1 (phá hủy DNA kép, nhưng vẫn chưa biết cách). Loại 5 được đặc trưng bởi Cas12, mà làm cho hai vết cắt trong một sợi đôi DNA.Loại 6 – Cas13 ("sự sụp đổ" RNA chuỗi đơn chuỗi thành nhiều phần nhỏ). PAM tham gia vào hoạt động của các hệ thống kiểu 1, 2, 5 và 6 (trong Hình 3 chúng được hiển thị với dấu hoa thị). Mỗi loại trong số 6 loại này có các bộ phận riêng: giờ đây có 19 kiểu con. Khoảng 90% số lượng vi khuẩn và 40% vi khuẩn ở dạng này hay dạng khác có bảo vệ CRISPR chống lại các phân tử và các yếu tố di động nước ngoài.

Nghiên cứu cas cho phép tái tạo lại sự phát triển có thể có của các hệ thống CRISPR. Người ta cho rằng chúng xuất hiện như là một dẫn xuất của các enzym biết cách cắt và khâu các phần tử di động vào trình tự nucleotide. Nó được phát hiện khi họ coi tổ tiên có thể. cas1. Tổ tiên của protein này không liên kết với CRISPR, nhưng được tham gia vào việc cắt và dán chính xác transposon. Gia đình của các protein tổ tiên này được gọi là casposone (xem M. Krupovic et al., 2015. Casposons: một siêu họ mới tự tổng hợp miễn dịch CRISPR-Cas). Rõ ràng là ý nghĩa cắt và dán các transposon tương tự như cắt và dán các miếng đệm mới. Do đó, một bộ công cụ tương tự phù hợp cho cả hai hành động – Cas1 và các dẫn xuất được sửa đổi của nó. Hơn nữa, caspozone có một chuỗi lặp lại mà có thể dễ dàng chuyển đổi và chuyên sâu vào các palindromes CRISPR.

Sự bảo vệ mạnh mẽ của vi khuẩn và cổ sinh vật dưới dạng di truyền CRISPR được thừa hưởng đã phát sinh như là kết quả của cuộc chạy đua vũ trang của vật chủ và ký sinh trùng. Vi khuẩn đã phát triển một hệ thống bảo vệ tinh vi hơn bao giờ hết, và vi-rút đã phát triển nhiều cách tinh vi hơn để phá vỡ sự bảo vệ này. Virus rất khó đánh bại sự bảo vệ CRISPR trong quần thể vi khuẩn, vì các tế bào vi khuẩn khác nhau mang một bộ đệm khác nhau. Do đó, một phage, thậm chí đã thay đổi trình tự trên một hoặc hai vị trí mục tiêu (protopacers) và đối phó với một hoặc hai crRNA, không thể đồng thời thay đổi toàn bộ các vị trí protopacener. Như các nghiên cứu đã chỉ ra, nếu dân số vi khuẩn ít nhất là đa dạng, thì virus tấn công là một thất bại (xem các nhà khoa học đã phát hiện ra tại sao khó khăn cho vi khuẩn để chống lại hệ miễn dịch của vi khuẩn, Elements, 18/4/2016). Do đó, cuộc chạy đua vũ trang đã dẫn đến thực tế rằng các virus đã thực hiện một con đường khác, "cố gắng" để tổ chức một hệ thống chống khủng bố chung của CRISPR. Nó liên quan đến việc tổng hợp các protein nhỏ (trình tự của chúng được mã hóa trong DNA của virus), ức chế các protein Cas, bao gồm Cas9 (xem A. Pawluk và cộng sự, 2016. Tự nhiên xuất hiện tắt cho CRISPR-Cas9).Từ quan điểm của virus, đây là một giải pháp rất xây dựng.

Trong năm 2011, công trình đã được công bố xác nhận khả năng chuyển CRISPR từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác (xem R.Sapranauskas et al., 2011. Streptococcus thermophilus Hệ thống CRISPR / Cas cung cấp khả năng miễn dịch trong Escherichia coli). Điều này đã mở ra những khả năng thực sự to lớn để sử dụng hệ thống CRISPR-Cas. Đây là nơi mà ý tưởng chỉnh sửa bộ gen bắt đầu với sự trợ giúp của bộ công cụ này. Sau khi tất cả, nó là, nếu bạn nghĩ về kéo phân tử, mà độc lập có thể tìm thấy một nơi được hình thành bởi các nhà nghiên cứu và cắt chính xác nơi cần thiết. Để làm điều này, bạn cần phải gắn kéo nuclease vào trình tự RNA với spacer và palindrome, sẽ được cắt nơi mà nhà nghiên cứu dự định – từ hai đầu của đoạn đích hoặc từ một đoạn. Và cho những gì kéo chính xác để sử dụng – một lựa chọn tuyệt vời. Đây là một số trong số họ.

Các phương pháp kiểu gen nhân bản vô tính và liên kết cùng một bộ đệm độc nhất đã được cải thiện đáng kể. Điều này đã bắt đầu sử dụng CRISPR trong ngành công nghiệp thực phẩm. Bây giờ không chỉ có thể chọn biến dạng mong muốn theo trình tự của các miếng đệm, mà còn để xác định chuỗi các cuộc họp của nó với các tác nhân thực vật, vì trình tự các miếng đệm CRISPR phản ánh lịch sử của các cuộc họp này (Hình 4).

Hình 4 Các cụm như vậy có thể thu được bằng cách nghiên cứu các trình tự CRISPR trong các chủng khác nhau: các chủng có cùng các băng cassette được nhóm lại với nhau (cụm 1); trong nhóm kia sẽ có các chủng với các miếng đệm bổ sung được chèn vào đầu băng cassette (chúng biểu hiện các đợt tấn công gần đây của virus ở các chủng con) (cụm 2); sẽ có các nhóm với các bộ đệm độc đáo sẽ chỉ ra một lịch sử riêng biệt của các chủng được nghiên cứu (các cụm 3, 4, 5). Hình ảnh từ R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Một thập kỷ khám phá: các chức năng và ứng dụng của CRISPR

Bạn có thể tạo lại hoặc tăng sức đề kháng của các chủng vi khuẩn với các loại thực khuẩn khác nhau. Tính ổn định trong trường hợp này có nghĩa là nhận biết chính xác kẻ địch và trung hòa của nó (có nhiều cách khác để tạo sự ổn định – ví dụ, đặt một rào chắn để lấy kẻ địch bên trong ô). Để tạo ra một chủng kháng thuốc, nó là cần thiết để giới thiệu hệ thống RNA / DNA tổng hợp vào các tế bào.cas. Hơn nữa, vi khuẩn chắc chắn sẽ nhúng một mảnh virus vào một băng CRISPR và có được sức đề kháng cần thiết. Đối với các chủng công nghiệp, tính kháng như vậy không gây tổn hại nhiều. Một cái gì đó giống như tiêm chủng. Hoặc trong cùng một cách để tổ chức nhạy cảm vĩnh viễn với thuốc kháng sinh cho các chủng thí nghiệm.Người ta biết rằng vi khuẩn, như một quy luật, nhanh chóng phát triển đề kháng với kháng sinh. Tuy nhiên, quá trình phát triển sức đề kháng có thể bị chậm lại: vì điều này bạn cần phải đặt một rào cản CRISPR cho plasmid mang các yếu tố di truyền kháng thuốc (Hình 5).

Hình 5 Cơ chế phát triển tính kháng với các loại thực vật hoặc các yếu tố di động do các miếng đệm được nhân tạo giới thiệu. Hình ảnh từ Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath, 2017. Một thập kỷ khám phá: các chức năng và ứng dụng của CRISPR

Về vấn đề này, điều quan trọng là hệ thống bảo vệ hoạt động không chỉ trong các tế bào prokaryotic, mà còn ở các sinh vật nhân chuẩn. Tất nhiên, một tế bào nhân chuẩn không thể đặt một spacer với một palindrome trong bộ gen của nó, nhưng phiên bản làm việc của crRNA-castrong đó RNA bổ sung cho trình tự đích trong bộ gen của virus sẽ rất hữu ích. Do đó, hiệu quả của crRNA- đã được thử nghiệm với thành công lớn.cas chống lại HIV. Các nhà khoa học đã làm việc với các nền văn hóa tế bào bị nhiễm virus này. Bằng cách xử lý chúng với crRNA-cas, mang chất đệm từ HIV, chúng loại bỏ các tế bào nhiễm trùng (xem W. Hu và cộng sự, 2014. nhiễm HIV-1). Các crRNA tìm thấy các trang web virus đưa vào hệ gen của tế bào và với sự giúp đỡ của Cas9 trung hòa chúng. Trong trường hợp này, việc xác định và cắt chuỗi là cực kỳ chính xác, không có "mảnh" DNA di động cần thiết bị hư hại.Điều này rất tốt cho việc tìm cách chữa trị HIV.

Và nếu biến dạng được xử lý bằng một thực thể, thì ADN được ghép vào các mảnh CRISPR bằng các miếng đệm từ bộ gen của chủng này, sau đó vi khuẩn sẽ bắt đầu tự hủy diệt. Bởi vì một máy phiên mã vi khuẩn chắc chắn sẽ đọc crRNA với các mảnh riêng của nó, và họ sẽ tìm thấy bổ sung trên bộ gen của vi khuẩn của họ và cắt chúng với nuclease riêng của họ (Hình 6). Đó là kế hoạch bảo vệ kháng khuẩn.

Hình 6 Nhiễm trùng với thực vật mang các yếu tố của bộ gen vi khuẩn trong băng CRISPR và sự kích hoạt của hệ thống này dẫn đến sự tự hủy diệt vi khuẩn. Hình ảnh từ R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Một thập kỷ khám phá: các chức năng và ứng dụng của CRISPR

Một hệ thống CRISPR có thể được điều chỉnh để chỉnh sửa bộ gen hoặc ngừng đọc các gen riêng lẻ. Trong trường hợp đầu tiên, nó sẽ là cần thiết để thêm enzyme sửa chữa để CRISPR (xem DNA sửa chữa). Sau đó, crRNA ở đúng nơi sẽ tham gia trình tự DNA, endonucleases sẽ cắt nó, và sửa chữa protein sẽ hoàn thành trình tự chính xác (Hình 7). Điều này có thể hữu ích cho việc tìm kiếm và chỉnh sửa các đột biến riêng lẻ. Trong trường hợp ức chế phiên mã, crRNA chỉ diễn ra đúng chỗ,RNA polymerase bị chặn và ngừng đọc. Đối với các mục đích như vậy, Cas9 đột biến được sử dụng, mà chuỗi DNA không phát sinh.

Hình 7 Chỉnh sửa, cũng như ức chế phiên mã trong tế bào vi khuẩn: bạn có thể chỉnh sửa đột biến bằng cách chèn một CRISPR với một spacer đột biến vào hệ gen của thực vật; crRNA với một spacer đột biến được tiếp tục xem xét, một nơi trong bộ gen của vi khuẩn sẽ được tìm thấy và chỉnh sửa bởi các protein sửa chữa; nếu một gen được sử dụng trong cấu trúc này cas9 với nykaza đột biến (dcas9), sau đó là đúng nơi sẽ được tìm thấy, nhưng sau khi hệ thống chỉ đơn giản là bị chặn. Hình ảnh từ R. Barrangou, P. Horvath, 2017. Một thập kỷ khám phá: các chức năng và ứng dụng của CRISPR

Để làm việc với các tế bào nhân chuẩn, một cấu trúc được xây dựng từ các protein crRNA và Cas hoạt động với DNA nhân chuẩn. Nó thậm chí không cần thiết để nhúng virus mang CRISPR-cas vào trong tế bào. Nếu một loạt các phân tử crRNA với đoạn đích và Cas mong muốn đi vào tế bào, thì crRNA tham gia chuỗi DNA, các hạt nhân sẽ cắt cẩn thận mảnh mong muốn, và các protein sửa chữa sẽ lại hoàn thành trình tự sửa chữa bằng ma trận bù. Ví dụ, công việc này được thực hiện để điều chỉnh thị lực ở chuột với viêm võng mạc sắc tố (xem W.-H. Wu và cộng sự, 2016).CRISPR sửa chữa cho thấy (mô hình tiền lâm sàng của viêm võng mạc pigmentosa).

Viêm võng mạc sắc tố là một căn bệnh trong đó sự hình thành các que trong võng mạc bị suy yếu. Nó thường được tìm thấy ở người (36 nghìn trường hợp được ghi nhận mỗi năm), nhưng đối với nghiên cứu có một mô hình của viêm võng mạc sắc tố ở chuột. Người ta biết rằng ở chuột bệnh này là do một trong hai đột biến trong gen gây ra Pde6b (đột biến với viêm võng mạc có tên rd1) – hoặc là một điểm đột biến Y347X, hoặc chèn virus Xmv-28, nhưng cái nào trong hai thứ này không rõ ràng. Nhiệm vụ dường như là điều này: để tìm hiểu xem hai đột biến nào gây mất thị lực và liệu có thể thực hiện được hay không, bằng cách loại bỏ đột biến, để cải thiện nó.

Để bắt đầu, các nhà khoa học đã tạo ra một sự kết hợp của các phân tử crRNA với Cas9, trong khi trong chuỗi RNA một khu vực với đột biến Y347X đã được dự tính. Sau đó, một phân tử nhà tài trợ, một oligonucleotide, với một đoạn bình thường, không đột biến, được nhắm mục tiêu được xây dựng. Tất cả các phức hợp này sử dụng plasmid được gửi đến trứng chuột thụ tinh với các đột biến của viêm võng mạc. Người ta cho rằng crRNA-Cas9 sẽ cắt bỏ phần đột biến của DNA, và trong khi đó, một oligonucleotide bình thường sẽ là cơ sở để hoàn thành phần cắt (Hình 8).

Hình 8 Đề án thí nghiệm với đột biến Y347X: trong exon của gen đột biếnPde6b (rd1) cuối cùng sẽ được chèn vào một phần của các nucleotide TAT thay vì TAA; Để làm điều này, đoạn TAA đầu tiên phải được cắt cẩn thận, và sau đó TAT được hoàn thành chính xác. Hình ảnh từ W.-H. Wu và cộng sự, 2016. Sửa chữa CRISPR cho thấy một mô hình tiền lâm sàng của viêm võng mạc sắc tố

Từ các hợp tử được xử lý theo cách này, chuột bình thường được phát triển, trong đó chúng kiểm tra các thông số khác nhau của các chức năng thị giác. Nói chung, việc điều trị đã làm việc: trong 7 trên 11 con vật, võng mạc trông khá khỏe mạnh (Hình 9), số lượng que là tương đối bình thường, và phản ứng sinh lý với ánh sáng trong võng mạc cũng phục hồi. Đúng, như các nhà nghiên cứu nhấn mạnh, trong một số trường hợp, các chỉ số của mắt phải và mắt trái khác nhau. Điều này có nghĩa là việc chèn và sửa chữa diễn ra trong một mẫu khảm, và không chỉ ở giai đoạn zygote, mà sau này, khi sự hình thành các cấu trúc đối xứng của phôi thai diễn ra.

Hình 9 Xem các quỹ của thần kinh thị giác ở chuột khỏe mạnh, trong đột biếnPde6b (rd1) và được chữa khỏi với phức hợp crRNA-Cas9; mạch máu bình thường và võng mạc bình thường trong trường hợp đầu tiên và cuối cùng và cấu trúc thoái hóa trong lần thứ hai có thể nhìn thấy được. Hình ảnh từ W.-H. Wu và cộng sự, 2016. Sửa chữa CRISPR cho thấy một mô hình tiền lâm sàng của viêm võng mạc sắc tố

Vì vậy, các tác giả kết luận rằng, bằng cách chỉnh sửa gen đột biến, trước tiên, có thể,chứng minh rằng ở chuột võng mạc sắc tố gây ra bởi một đột biến điểm, không phải là một chèn virus (nó vẫn không thay đổi trong những con chuột được chữa khỏi). Thứ hai, và quan trọng nhất, điều chỉnh thành công các chức năng thị giác của đột biến. Thật vậy, ở người, căn bệnh này là do đột biến ở một gen tương tự.

Công trình này cũng có sự tiếp tục (xem K. A. Schaefer và cộng sự, 2017. Những đột biến bất ngờ sau khi chỉnh sửa CRISPR-Cas9 in vivo), phản ánh quá trình khoa học tiến bộ nói chung và trong một phòng thí nghiệm đơn lẻ. Cùng một nhóm đã kiểm tra xem việc chỉnh sửa CRISPR có an toàn cho động vật và liệu nó có hậu quả không mong muốn hay không. Một nghiên cứu như vậy về nguyên tắc là cần thiết vì bất kỳ tác nhân điều trị nào cũng không có tác dụng phụ nghiêm trọng. Và nếu bạn điều trị viêm võng mạc, thì ở những nơi khác của bộ gen không xuất hiện đột biến không cần thiết. Kiểm tra này mất một năm. Đối với điều này, cần phải thực hiện trình tự DNA toàn bộ bộ gen của chuột đã được chữa khỏi, và sau đó so sánh các đột biến thu được với các đột biến có thể có trong loại hoang dã và chuột không được điều trị từ dòng đột biến rd1. Các đột biến độc đáo chỉ xảy ra ở chuột được chữa khỏi và rất có thể là những phần phụ không mong muốn.

Có rất nhiều đột biến độc đáo như vậy, khoảng một nghìn rưỡi.Trong số này, 1397 xảy ra trong các đột biến điểm và 117 trong chèn và xóa, cao gấp hàng trăm lần so với nền đột biến thông thường. Người ta tin rằng với các hoạt động của crRNA-Cas9, nó có nhiều khả năng mong đợi chèn hoặc xóa không mong muốn. Nhưng hình ảnh chỉ là sự đối lập, điểm đột biến nhất. Những con số này có nghĩa là dự đoán các đột biến phụ dựa trên phân tích tin sinh học có thể đánh giá thấp một số yếu tố quan trọng. Và cho đến khi các phương pháp ước lượng được cải thiện, tốt hơn là dựa vào trình tự bộ gen toàn bộ. Rõ ràng là phương pháp vẫn yêu cầu tinh lọc kỹ thuật, mặc dù tiềm năng trị liệu của nó là đặc biệt cao.

Nguồn:
1) Rodolphe Barrangou, Christophe Fremaux, Hélène Deveau, Melissa Richards, Patrick Boyaval, Sylvain Moineau, Dennis A. Romero, Philippe Horvath. CRISPR cung cấp khả năng chống lại virus trong prokaryotes // Khoa học. 2007. V. 315. P. 1709-1712. DOI: 10.1126 / science.1138140.
2) Rodolphe Barrangou, Philippe Horvath. Một thập kỷ khám phá: các hàm và ứng dụng CRISPR // Vi sinh vật tự nhiên. 2017. V. 2. Số bài viết: 17092. DOI: 10.1038 / nmicrobiol.2017.92.
3) Wen-Hsuan Wu, Yi-Ting Tsai, Sally Justus, TingTing Lee, LiJuan Zhang, Chyuan-Sheng Lin, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan, Stephen H. Tsang. Sửa chữa CRISPR cho thấy một mô hình tiền lâm sàng của viêm võng mạc pigmentosa // Liệu pháp phân tử. 2016. V. 24. I. 8. P. 1388-1394. DOI: //dx.doi.org/10.1038/mt.2016.10.
4) Kellie A. Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F. Colgan, Stephen H. Tsang, Alexander G. Bassuk, Vinit B. Mahajan. Các đột biến bất ngờ sau khi chỉnh sửa CRISPR-Cas9 in vivo // Phương pháp thiên nhiên. 2017. V. 14. P. 547-548. DOI: 10.1038 / nmeth.4293.

Elena Naimark


Like this post? Please share to your friends:
Trả lời

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: