Hệ thống CRISPR-CAS9 được quản lý để chụp ảnh trong hành động • Anastasia Pashutova • Tin tức khoa học về "Yếu tố" • Sinh học phân tử, Di truyền học

Hệ thống CRISPR-CAS9 được quản lý để quay

Hình 1. Cơ chế của hệ thống Crispr-Cas. 1 – Phân đoạn DNA của virus mà tế bào gặp phải lần đầu tiên (màu đỏ) được đưa vào locus CRISPR, nơi mà các phân đoạn DNA của virus mà tế bào đã gặp trước đây đã được lưu trữ (mũi tên đầy màu sắc). 2 – trên cơ sở thư viện CRISPR, các hướng dẫn RNA được tạo ra, tạo thành một phức hợp với protein Cas (hình bầu dục màu tím). 3 – Khi phức hợp Cas-RNA gặp DNA virus (màu xanh lục), bổ sung cho RNA hướng dẫn, nó kết nối với nó và phá hủy, cắt thành từng mảnh. Hình ảnh từ gesundheitsindustrie-bw.de

Mặc dù đã có lịch sử hơn mười năm nghiên cứu hệ thống CRISPR-Cas và áp dụng nó cho việc chỉnh sửa bộ gen, cho đến nay chưa có ai xem nó tại nơi làm việc. Các nhà khoa học Nhật Bản đã loại bỏ khoảng trống này và là người đầu tiên trên thế giới có được một đoạn video về quá trình này bằng cách sử dụng kính hiển vi lực nguyên tử tốc độ cao. Hóa ra là các yếu tố của hệ thống liên kết với các phân tử DNA theo một cách khác với suy nghĩ trước đây: chúng không bò dọc theo các phân tử này để tìm kiếm đúng nơi, nhưng tìm nó bằng cách khuếch tán ba chiều.

Hệ thống CRISPR-Cas9, được sử dụng để chỉnh sửa bộ gen hướng, đã trở nên phổ biến trong giới khoa học.Số lượng bài viết đề cập đến hệ thống này đang tăng lên nhanh chóng mỗi năm (bắt đầu với một số bài báo trong năm 2011 và kết thúc với hơn hai nghìn bài báo trong năm 2017).

Nhớ lại rằng CRISPR-Cas là hệ miễn dịch của vi khuẩn. Giống như hệ miễn dịch của chúng ta, trong đó có:
1) tế bào bộ nhớ, nhiệm vụ là nhớ "kẻ thù" trên mặt và lưu thông tin về anh ta (ví dụ, một quần thể tế bào lympho đặc biệt lưu trữ thông tin về vũ khí đã sử dụng trước đây chống lại tác nhân gây nhiễm và tạo thành đáp ứng miễn dịch thứ cấp);
2) các tế bào sẽ trực tiếp chiến đấu với kẻ thù (ví dụ, T-kẻ giết người);
vi khuẩn cũng có một cơ chế nhằm loại bỏ các tác nhân gây nhiễm trùng. Chỉ trong vi khuẩn, các tế bào riêng lẻ không chịu trách nhiệm miễn dịch, nhưng các axit nucleic (DNA và RNA) và các protein đặc biệt thích nghi với mục đích này. CRISPR (lặp lại thường xuyên xen kẽ các đoạn lặp ngắn palindromic), một phức hợp các đoạn DNA lặp đi lặp lại, làm nền tảng cho hệ miễn dịch của vi khuẩn. Giữa chúng có những miếng đệm – các dải phân cách với các đoạn gen của virus – di truyền “chân dung” của những người mà vi khuẩn này đã gặp phải. Đây là một căn cứ đặc biệt của những kẻ vi phạm trong bộ gen của vi khuẩn.

Nó hoạt động như thế này.Nếu một loại virus mà cô chưa từng thấy trước đây và cố gắng chống lại nó xâm nhập vào vi khuẩn, thì cô sẽ để lại một mảnh DNA virus nhỏ trong bộ nhớ, và nó sẽ được lưu trữ trong locus CRISPR (Hình 1). Sau đó, cần dịch chuỗi nucleotide thu được từ virus thành dạng có khả năng nhắm vào protein Cas. Đối với điều này, một RNA hướng dẫn (gRNA) được tạo ra, lặp lại đoạn ADN của virus được chèn vào đáy. Như một quy luật, hướng dẫn RNA được tạo ra liên tục và ở tốc độ khá thấp, nhưng khi một tế bào va chạm với virus hoặc trong điều kiện căng thẳng, tốc độ tăng đáng kể. Sau khi RNA được tạo ra, nó liên kết với phức hợp protein Cas. Bây giờ phức tạp Cas-gRNA, giống như một cảnh sát với một tên của một tên tội phạm, có thể tuần tra một tế bào. Khi một đoạn DNA ngoại lai được tìm thấy bổ sung cho RNA hướng dẫn, phức hợp liên kết với mảnh này và các protein Cas tách nó giống như một cặp kéo phân tử. Để biết thêm thông tin về cơ chế phân tử này, xem, ví dụ, bài viết của D.E. Dzhagarov Smart Scissors cho DNA.

Được phát hiện gần 30 năm trước, trong hơn 20 năm, hệ thống này chỉ quan tâm đến các nhà sinh vật học phân tử, những người đang cố gắng hiểu các đặc tính của cơ chế bảo vệ độc đáo này.Vào năm 2012, tiềm năng của các hệ thống CRISPR-Cas9 đã được xác định là một công cụ để chỉnh sửa bộ gen có thể bắt đầu các thay đổi di truyền được nhắm mục tiêu trong hầu như bất kỳ sinh vật nào. Trong những năm tiếp theo, bằng cách sử dụng phương pháp này, các nhà khoa học quản lý, ví dụ, để loại bỏ chuột của các bệnh di truyền (JR Mendell, LR Rodino-Klapac, 2016. Chứng loạn dưỡng cơ Duchenne: điều trị CRISPR / Cas9), để chữa bệnh cho động vật từ HIV (C. Yin et al., 2017. In Vivo Excision của RNA đơn hướng dẫn trong mô hình động vật, và thậm chí chỉnh sửa bộ gen của phôi và người lớn (xem P. Liang et al., 2015. chỉnh sửa gen CRISPR / Cas9 qua trung gian trong các nhà khoa học Trung Quốc đi tiên phong trong thử nghiệm CRISPR đầu tiên của con người). Đọc về lịch sử và kết quả chính của việc áp dụng phương pháp này trong tin tức Kết quả của thập kỷ đầu tiên của nghiên cứu CRISPR đã được tóm tắt ("Elements", 13.07.2017).

Mặc dù có tiến bộ đáng kể, cho đến ngày nay vẫn chưa có một quan sát trực tiếp nào về chức năng của hệ thống này. Khoảng cách này được loại bỏ bởi một nhóm các nhà khoa học Nhật Bản do Mikihiro Shibata (Mikihiro Shibata) lãnh đạo sử dụng kính hiển vi lực nguyên tử tốc độ cao (HS-AFM), cho phép phân tử hình ảnh và thậm chí là các nguyên tử riêng lẻ. Bài viết về nghiên cứu được công bố trên tạp chí Giao tiếp tự nhiên.

Với sự giúp đỡ của hình ảnh HS-AFM, động lực học protein có thể được xác định với các chi tiết tuyệt vời.Ví dụ, các nhà khoa học trước đây, trong số đó là một số tác giả của tác phẩm đang thảo luận, đã quản lý để nắm bắt những thay đổi về cấu trúc của phân tử bacteriorhodopsin (M. Shibata và cộng sự., 2010. Kính hiển vi phân tử nguyên tử và quan sát phân tử). myosin, đi qua sợi actin (N. Kodera và cộng sự, 2010. Kính hiển vi lực nguyên tử tốc độ cao).

Nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi lực nguyên tử dựa trên tương tác giữa các phân tử giữa bề mặt mẫu và đầu dò. Đầu dò là một mũi nhọn có kích thước nano nằm ở phần cuối của thanh côngxon đàn hồi. Bề mặt được quét có thể thu hút hoặc đẩy lùi đầu dò, làm cho cần trục uốn cong (Hình 2). Uốn cong này được đăng ký với sự trợ giúp của một tia laser, được phản xạ từ một máy đúc, chạm vào một máy dò ảnh nhạy cảm (xem bài viết của A. Kuramshin để biết chi tiết. Nhìn vào các nguyên tử, chạm vào phân tử). Kính hiển vi lực nguyên tử tốc độ cao hoạt động trên nguyên tắc tương tự. Sự khác biệt duy nhất là cantilever được sử dụng, nhỏ hơn hàng ngàn lần so với sử dụng trong AFM cổ điển, cho phép tăng tốc độ thu nhận hình ảnh.

Hình 2 Đề án của kính hiển vi lực nguyên tử. Hình ảnh từ simple.wikipedia.org

Bản thân các nhà khoa học đã chuẩn bị các phân tử cần thiết cho nghiên cứu này. Protein Cas9 được tổng hợp trong tế bào E.coli. E. colivà sau đó được tinh chế bằng phép sắc ký cột. Nhắm mục tiêu RNA và DNA mục tiêu tổng hợp in vitro. Ngoài ra, một chất nền đặc biệt đã được chuẩn bị mà sau đó các chất sinh học sinh học được đặt vào. Các yêu cầu sau đây được đưa ra cho các chất nền được sử dụng cho AFM: bề mặt phải đủ mịn và hấp thụ tốt các vật thể đang nghiên cứu. Khi quét phân tử sinh học thường sử dụng chất nền mica. Và mặc dù các chất nền như vậy có bề mặt ưa nước với các phần tử nguyên tử lớn hơn 100 micron, chúng có nhiều nhược điểm – ví dụ, điện tích bề mặt âm (có thể can thiệp vào DNA, vì các nhóm phosphate cũng có điện tích âm) và khả năng ngăn chặn sự khuếch tán tự do phức hợp. Để khắc phục những thiếu sót này, các nhà nghiên cứu đã sửa đổi bề mặt mica theo hai cách khác nhau:
1) xử lý bề mặt mica bằng dung dịch APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilane), do đó một màng được hình thành trên bề mặt mica, có điện tích dương trong nước.
2) một lớp kép lipid được hình thành trên bề mặt mica, do đó sự tương tác giữa phức hợp Cas9-RNA và mica được giảm thiểu.

Điều đầu tiên các nhà khoa học Nhật Bản đã làm là cố gắng chụp ảnh protein Cas9 mà không cần chỉ đạo RNA. Trước đó, những thay đổi trong protein Cas9 xảy ra trong quá trình hoạt động của nó đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng phân tích nhiễu xạ tia X (PCA). Phương pháp này cho phép để có được một cấu trúc ba chiều của phân tử, ví dụ, một protein (xem A. Oganov, 10 sự kiện về tinh thể). Tóm lại, quá trình lấy một hình ảnh bằng phương pháp này bao gồm các bước sau: tạo ra một dung dịch protein bão hòa đã trải qua quá trình tinh lọc, quá trình kết tinh của mẫu, thu thập dữ liệu tán xạ tia X và xử lý trực tiếp dữ liệu, bao gồm mô phỏng máy tính.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng phân tử Cas9 ở trạng thái tự do có cấu trúc cứng nhắc. Để kiểm tra điều này, các nhà khoa học Nhật Bản đã lấy các mẫu tinh thể thu được bởi một nhóm các nhà nghiên cứu khác, và so sánh chúng với các hình ảnh thu được trên AFM. Hóa ra là protein tự do có cấu trúc di động khác với cấu trúc cứng nhắc quan sát được trong tinh thể (Hình 3, b, c).Đó là, dữ liệu thu được trước đó bằng cách sử dụng XRD hóa ra là không liên quan, vì chúng không tương ứng với cấu trúc của protein ở trạng thái tự nhiên của nó.

Hình 3 b– Cấu trúc tinh thể, từ trái sang phải: Cas9 đơn, một phức hợp Cas9-RNA, Cas9-RNA, liên kết với một DNA đích đơn lẻ, và Cas9-RNA, liên kết với đích của nó (DNA sợi kép). Màu sắc khác nhau các miền chức năng được chỉ định của protein: màu xám trắng mảnh – lưỡi dao xoắn alpha, màu hồng – miền nuclease của HNH, phân tách DNA mục tiêu, màu lam – miền nuclease của RuvC, tách một chuỗi DNA không được nhắm mục tiêu, màu be – Miền PAM nhận ra một đoạn DNA mục tiêu đặc biệt. cd – hình ảnh liên tiếp thu được bằng kính hiển vi lực nguyên tử tốc độ cao: đơn Cas9 (c) và phức tạp Cas9-RNA ( d ). Đuôi nhỏ chỉ ra mũi tên, đây là một mảnh RNA nhô ra từ thùy alpha-xoắn. Cân ở bên phải hiển thị chiều cao của đối tượng trên bề mặt. Hình ảnh từ bài viết trong thảo luận Giao tiếp tự nhiên

Sau đó, các nhà nghiên cứu đã quay phức tạp Cas9 với hướng dẫn RNA. Không giống như một protein đơn lẻ, phức hợp Cas9-RNA có kiến ​​trúc bilobed ổn định tương ứng với cấu trúc tinh thể (Hình 3, b, d, xemcũng là video số 2 từ các tài liệu bổ sung cho bài viết đang thảo luận).

Bước tiếp theo là hình dung ràng buộc của phức hợp Cas9-RNA với DNA mục tiêu. Để bắt đầu, tất cả “người tham gia” được hấp phụ lên bề mặt của chất nền: các phức hợp phân tử của Cas9-RNA và DNA mục tiêu. Trong video, bạn có thể thấy rằng phức hợp Cas9-RNA đặc biệt liên kết với mục tiêu DNA của nó. Tất cả điều này được thực hiện trong sự vắng mặt của các ion magiê Mg2+. Các ion của kim loại này là cần thiết cho hoạt động thích hợp của các hạt nhân, do đó phức tạp liên kết với DNA mà không có magiê, nhưng không phân tách hơn nữa (Hình 4; xem thêm video số 3 từ các tài liệu bổ sung cho bài viết đang thảo luận).

Hình 4 Khu phức hợp Cas9-RNA, cụ thể (tức là, tại một địa điểm cụ thể nơi việc cắt sẽ xảy ra) được kết hợp với mục tiêu của nó khi không có ion Mg2+, không cắt DNA. Hình ảnh từ bài viết trong thảo luận Giao tiếp tự nhiên

Để hình dung quá trình phá vỡ DNA, các nhà nghiên cứu lặp lại bước trước đó, nhưng đã thêm magiê. Sau đó, protein Cas9 có thể cắt DNA. Video này cho thấy cách, sau khi chèn các đứt gãy kép, một phần của DNA được giải phóng khỏi phức hợp (Hình 5 và video).

Hình 5 Phức tạp Cas9-RNA trong sự hiện diện của các ion Mg2+ cắt giảm DNA. Mũi tên trắng và hồng chỉ ra miền nuclease của NHN ở trạng thái không hoạt động và hoạt động. Phát hành cuối sợi DNA được hiển thị. mũi tên xanh trên khung hình cuối cùng. Hình ảnh từ bài viết trong thảo luận Giao tiếp tự nhiên

Phức tạp Cas9-RNA cắt phân tử DNA

Do thiếu độ phân giải hình ảnh, thật không may, nó vẫn chưa biết phần còn lại của phân tử DNA trong phức hợp được giải phóng ra sao.

Các nhà khoa học cũng đã thành công trong việc bác bỏ lý thuyết về chính xác phức hợp Cas9-RNA liên kết với vùng cần thiết trên phân tử DNA: trước đây người ta tin rằng protein liên kết với RNA “trượt” dọc theo DNA để tìm kiếm một vùng bổ sung. Để kết thúc này, các nhà nghiên cứu sử dụng một chất nền dựa trên bilipid để giảm thiểu sự tương tác giữa mica và protein, có thể can thiệp vào sự khuếch tán tự do của phức hợp. Hóa ra là Cas9 không có RNA hướng dẫn liên kết với phân tử DNA và chỉ trượt dọc theo nó. Nhưng khi protein có RNA bổ sung cho vị trí mong muốn, phức không trượt, nhưng được liên kết trực tiếp với mục tiêu (Hình 6, xem thêm video số 7 từ các tài liệu bổ sung cho bài viết đang thảo luận). Rõ ràng, sự hiện diện của RNA hướng dẫn ngăn cản phức hợp Cas9-RNA từ “phân tán” DNA để trượt dọc theo nó.Vì vậy, sự ràng buộc xảy ra do sự khuếch tán ba chiều: các phức hợp trôi nổi trong dung dịch, và nếu chúng may mắn ở gần đoạn DNA mong muốn, chúng liên kết với nó.

Hình 6 một – một số protein Cas9 (được đánh dấu mũi tên), thiếu RNA hướng, trượt dọc theo phân tử DNA. b – phức tạp Cas9-RNA ngay lập tức liên kết với các trang web mong muốn, ngay sau khi nó là bên cạnh nó do khuếch tán ba chiều. Trong khung thứ hai, một vài phân tử ADN được nhìn thấy, một trong số đó là phức hợp Cas9-RNA đang ngồi (mũi tên dưới cùng), và mặt khác có một nơi mà một phức hợp khác sẽ liên lạc sau đó (mũi tên trên cùng). Trong khung hình thứ tư và thứ năm, rõ ràng là Cas9-RNA xuất hiện ở đúng nơi cùng một lúc và không trượt dọc theo DNA. Hình ảnh từ bài viết trong thảo luận Giao tiếp tự nhiên

Những video nhiễu hạt và dường như vụng về này khiến các nhà khoa học trên khắp thế giới thở hổn hển với niềm vui sướng. Một mặt, hệ thống CRISPR-Cas9 hoạt động như dự đoán trước đó. Mặt khác, các chi tiết mới đã được đưa ra ánh sáng trong cách phức tạp protein liên kết với phân đoạn DNA chính xác. Nói chung, nghiên cứu này cung cấp chi tiết chưa từng có về các động lực chức năng của CRISPR-Cas9 và nhấn mạnh tiềm năngkính hiển vi lực nguyên tử tốc độ cao để xác định cơ chế hoạt động của các phân tử liên kết với axit nucleic.

Nguồn: Mikihiro Shibata, Hiroshi Nishimasu, Noriyuki Kodera, Seiichi Hirano, Toshio Ando, ​​Takayuki Uchihashi & Osamu Nureki. CRISPR-Cas9 thời gian thực và động lực thời gian thực được hiển thị bằng kính hiển vi lực nguyên tử tốc độ cao // Giao tiếp tự nhiên. 2017. DOI: 10.1038 / s41467-017-01466-8.

Anastasia Pashutova


Like this post? Please share to your friends:
Trả lời

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: